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細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力檢測(cè)方法

更新時(shí)間:2022-05-25      點(diǎn)擊次數(shù):6841

一、細(xì)胞增殖與細(xì)胞活性

  細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要?理功能之?,細(xì)胞增殖與細(xì)胞活性檢測(cè)所用的方法相近,但實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌<?xì)胞增殖是通過細(xì)胞增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)判斷細(xì)胞的數(shù)量變化,例如細(xì)胞計(jì)數(shù)法,反應(yīng)的就是細(xì)胞真實(shí)的數(shù)量。而細(xì)胞活性檢測(cè),則是通過檢測(cè)細(xì)胞受到藥物或其他措施處理后,標(biāo)志物產(chǎn)量或濃度的變化,進(jìn)而判斷藥物或處理措施的作用,細(xì)胞活性檢測(cè)所得結(jié)論,往往反映了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的。

  細(xì)胞增殖檢測(cè),因檢測(cè)標(biāo)志物的不同,目前大致分為四類:DNA合成檢測(cè)、代謝活性檢測(cè)、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測(cè)和ATP濃度檢測(cè)。細(xì)胞活性檢測(cè)通常包括細(xì)胞膜對(duì)核酸染料的通透性、代謝活性、膜電位等的檢測(cè),確定細(xì)胞的代謝活?或細(xì)胞代謝產(chǎn)物,通過檢測(cè)細(xì)胞的氧化還原活性反映細(xì)胞增殖能?。

二、常見細(xì)胞增殖檢測(cè)方法

1.DNA合成檢測(cè)——BrdU / EdU檢測(cè)法

  細(xì)胞在增殖過程中,DNA的倍增,是顯著的變化之一,通過檢測(cè)DNA量的變化,可判斷細(xì)胞數(shù)量的變化。通過檢測(cè)DNA進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)方法,除了同位素標(biāo)記DNA外,常用的就是:BrdU / EdU檢測(cè)法。BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶(T)的衍生物,可代替胸腺嘧啶在摻入S期的DNA合成,然后利用抗Brdu的單克隆抗體,ICC染色,顯示增殖細(xì)胞,如果與其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙染,則可判斷增殖細(xì)胞的種類,增殖速度,對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。

  Edu檢測(cè)法是BrdU的替代方法,也是目前更廣泛適用的方法,RrdU需抗體在破開DNA雙聯(lián)后與抗原分子集合后才能顯示,這個(gè)處理過程對(duì)細(xì)胞有損傷,而EdU同樣可以代替胸腺嘧啶(T)滲入DNA,但其分子大小只有BrdU的1/500,可以直接在DNA雙鏈形態(tài)下與染料分子結(jié)合用于檢測(cè),無需抗體結(jié)合反應(yīng),實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單,對(duì)細(xì)胞損傷小,是新一代基于DNA檢測(cè)時(shí)報(bào)增殖的試劑。



2.代謝活性物質(zhì)檢測(cè)——MTT、CCK8

  MTT與CCK8兩種方法都是利用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體中琥珀酸脫氫酶濃度,進(jìn)而反映細(xì)胞增殖活性。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)被琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并堆積在細(xì)胞內(nèi),然后以DMSO溶解甲瓚,通過檢測(cè)甲瓚的吸光度來間接反映存活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

  CCK8中的主要物質(zhì)WST-8是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成橙黃色的、水溶性formazan。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深;反之,則顏色越淺。CCK-8的原理跟MTT其實(shí)是相同的,不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的,不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機(jī)溶劑溶解這個(gè)步驟,對(duì)細(xì)胞毒性小,可進(jìn)行活細(xì)胞動(dòng)態(tài)測(cè)定,試劑穩(wěn)定即開即用,重復(fù)性好于MTT。



3.細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測(cè)

  Ki-67,PCNA都是細(xì)胞增殖因子,在細(xì)胞異常增殖中均有顯著的表達(dá)差異,是研究腫瘤細(xì)胞增殖的重要核抗原。Ki-67,PCNA均與細(xì)胞周期密切相關(guān),通過免疫反應(yīng)檢測(cè)Ki-67,PCNA可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖情況。



4.ATP濃度檢測(cè)

  細(xì)胞內(nèi)的ATP是細(xì)胞能量的重要來源,其含量與細(xì)胞周期和細(xì)胞狀態(tài)關(guān)系密切,死細(xì)胞或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP。在細(xì)胞中測(cè)得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用熒光素酶Luciferase及其底物熒光素Luciferin的ATP檢測(cè)以生物發(fā)光為基礎(chǔ),能夠?yàn)槟峁┓浅l`敏的結(jié)果。如果有ATP存在熒光素酶就會(huì)發(fā)光,而且其發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比,這種方法非常適用于高通量細(xì)胞增殖檢測(cè)和篩選。Promega公司開發(fā)的CellTiter-Glo Luminescent 實(shí)現(xiàn)了"加樣-混合-測(cè)量"的簡(jiǎn)單快速檢測(cè)模式,CellTiter-Glo試劑和細(xì)胞培養(yǎng)中的常用培養(yǎng)基兼容,如RPMI 1640, MEM, DMEM, 和Ham's F12,且不受酚紅和有機(jī)溶劑的影響,可用于高通量自動(dòng)化篩選(HTS)。



5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測(cè)法

  羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料,具有與細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán),CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí),CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中,子代細(xì)胞熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半,在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中,各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度遞減,利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。

三、細(xì)胞增殖/活性檢測(cè)方法比較

常見細(xì)胞增殖/活性檢測(cè)方法比較見下表(含李記生物產(chǎn)品、貨號(hào))

檢測(cè)試劑試劑盒原理適用樣本檢測(cè)設(shè)備生產(chǎn)廠家
EdU/BrdU檢測(cè)試劑盒李記新品:AC11L251
檢測(cè)新新合成DNA在細(xì)胞增殖過程,檢測(cè)加入到新合成DNA的胸苷類似物(BrdU, EdU)細(xì)胞樣本或組織樣本流式細(xì)胞術(shù)
成像分析

酶標(biāo)儀
李記生物
GeneCopoeia
CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針(李記貨號(hào):AC11L101)通過檢測(cè)親代和子代細(xì)胞中染料CFSE濃度進(jìn)行細(xì)胞增殖次數(shù)分析細(xì)胞樣本流式細(xì)胞術(shù)李記生物
Thermofisher
Cell Counting Kit(CCK-8 試劑盒)(李記貨號(hào):AC11L054)通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的還原能力,反應(yīng)細(xì)胞活性。檢測(cè)細(xì)胞還原能力熒光信號(hào)與代謝中的活細(xì)胞數(shù)量成正比細(xì)胞樣本,HTS酶標(biāo)儀李記生物
日本東仁化學(xué)
AlamarBlue細(xì)胞活性檢測(cè)染料分子在細(xì)胞內(nèi)被還原后釋放到胞外,檢測(cè)熒光,提示細(xì)胞代謝變化細(xì)胞樣本,HTS酶標(biāo)儀李記生物
Thermofisher
CTG
CellTiter-Glo
李記研發(fā)中
ATP使熒光素酶發(fā)射熒光細(xì)胞樣本,HTS酶標(biāo)儀李記生物
Promega



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